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Este estudio tuvo por objeto determinar el número de subcultivo y el diámetro basal en el cual se obtiene la mayor tasa de enraizamiento ex vitro para microtallos de castaño, Castanea sativa Mill., obtenidos vía cultivo in vitro. El material vegetal correspondió a microtallos provenientes del cultivo de embriones con entre 7 y 12 subcultivos durante la etapa de proliferación, para la cual se utilizó medio Driver y Kuniyuki Walnut (DKW) con los macronutrientes reducidos a la mitad y suplementado con 1 mg L^-1 6-benzilaminopurina (BAP) y 0,1 mg L^-1 de ácido indol 3-butírico (AIB). Se utilizó el método de inducción rápida de enraizamiento sumergiendo los tallos en una solución de 0,5 mg mL^-1 de AIB durante 15 min. Para la etapa de enraizamiento, se utilizó como sustrato corteza de pino:perlita (4:1, v/v) evaluando los resultados a los 20 días de cultivo. Las variables evaluadas fueron tasa de supervivencia (%), tasa de enraizamiento (%), número de raíces, largo de raíces (mm), presencia de callo y aspecto del sistema radicular. Los resultados mostraron una disminución de la capacidad de enraizamiento a medida que aumenta el número de subcultivo. El factor diámetro de microtallo no presentó diferencias significativas respecto a las variables evaluadas.