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En el presente estudio se evaluó la factibilidad de reducir el tiempo de la segunda etapa de incubación con pepsina en la determinación de la digestibilidad de la materia seca (dms) realizada in vitro para una pradera de alfalfa. La acción de la pepsina fue optimizada aumentando cantidad y temperatura de incubación. Se usaron 900 unidades/tubo de pepsina y tiempo de incubación de 0, 4, 6, 24 y 48 horas. A 40 °C (temperatura tradicional) y 50 °C (muy cercana al óptimo de la enzima), los resultados se ajustaron a un modelo de dobles recíprocos, que indicaron que con 4 horas de incubación a 50 °C, se logran resultados comparables con 48 horas de incubación a 40 °C. Se encontró que la cantidad de pepsina de 900 unidades/tubo se puede reducir hasta 540 unidades/tubo obteniéndose los mismos resultados. Finalmente, se concluye que es factible acortar el tiempo que toma el análisis de dms realizada in vitro manteniendo la etapa de incubación con líquido ruminal a 40 °C por 48 horas y reduciendo el tiempo de incubación con pepsina de 48 horas, a 4 horas y 50 °C para una muestra de pradera de alfalfa, lo que se traduce en un considerable ahorro de tiempo y una mayor capacidad de análisis durante una semana de trabajo.